五大工程的定义、研究内容。

1. 基因工程：在基因水平上操作并改变生物遗传特性的技术。即按照人们的需要，用类似工程设计的方法将不同来源的DNA 分子在体外构建成重组DNA 分子，然后导入受体细胞，并在受体细胞内复制、转录和表达。

2. 细胞工程：以细胞为基本单位，在体外条件下进行培养、繁殖或人为地使细胞某些生物学特性按人们的意愿发生改变，达到改良生物品种和创造新品种的目的，从而加速繁育动植物个体，或获得某种有用物质。

3. 蛋白质工程：以蛋白质结构和功能的研究为基础，运用遗传工程的方法，借助计算机信息处理技术，从改变和合成基因入手，定向改造天然蛋白质或设计全新的蛋白质，使之具有特定的结构、性质和功能，更好地为人类服务。

4. 发酵工程：利用包括工程微生物在内的某些微生物或动、植物细胞及其特定功能，通过现代工程技术手段生产各种特定的有用物质；或者把微生物直接用于某些工业化生产。

5. 酶工程：利用酶、细胞器或细胞所具有的特异催化功能，以及对酶的修饰改造，借助于生物反应器，生产人类所需产品。

基因工程研究的理论依据是什么？

1. 不同基因具有相同的物质基础；

2. 基因是可以切割的；

3. 基因是可以转移的；

4. 多肽与基因之间存在对应关系；

5. 遗传密码是通用的；

6. 基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代。

基因工程的工具酶有哪些？其作用是什么？

1. 限制性核酸内切酶，一类识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的核苷酸内切酶；

2. DNA 连接酶，催化双链DNA 片段紧靠在一起的3'-OH 与5'-P 基团之间形成磷酸二酯键，连接两末端的酶；

3. DNA聚合酶，能够催化DNA 复制和修复DNA 分子损伤的一类酶；

4. 碱性磷酸酶，用于脱去DNA （RNA ）5' 末端的磷酸根，使5'-P 成为5'-OH ，此过程称核酸分子的脱磷酸作用；

5. S1核酸酶，水解单链DNA 或RNA ，产生带5'-P 的单核苷酸或寡核苷酸。双链DNA 或RNA 、DNA:RNA杂交体，对此酶相对不敏感。可将粘性末端水解成平末端。可打开双链cDNA 合成中形成的发夹式结构。

基因工程的载体有哪些？载体的功能有哪些？

1. 克隆载体：克隆一个基因或DNA 片段；

2. 表达载体：用于一个基因的蛋白表达；

3. 整合载体：将携带基因插入到染色体组中。

Southern 杂交、Northern 杂交的概念是什么？

1. DNA 印迹杂交（Southern Blotting ）：根据毛细作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA 片段转移并结合在适当的滤膜上。用标记的单链DNA 或RNA 探针，检测膜上的DNA 片段。

2. RNA印迹技术（Northern blotting）：将RNA 分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤膜上，进行核酸杂交的一种实验方法。

PCR 技术的概念、原理及步骤。

概念：即聚合酶链式反应，体外快速扩增特定基因或DNA 片段的方法。

原理：1、DNA 是半保留复制的；2、温度可以控制DNA 的变性和复性；3、Taq 酶能够耐住高温反复使用。

步骤：变性、退火、延伸、多次循环后检测。

目的基因的制备方法有哪些？

1. 反转录法；

2. 从细胞基因组中直接分离（基因组DNA 文库，cDNA 文库）；

3. PCR从基因组中扩增出目的基因；

4. 化学合成法。

如何提高目的基因与载体连接的效率？

1. 提高目的基因浓度；

2. 粘性末端：去磷酸处理；

3. 平末端加同聚物：用末端脱氧核苷酸转移酶，在DNA 片段平末端加上poly(A/T/G/C)尾巴之后尾互补粘性末端的DNA 片段；

4. 平末端加衔接物linker/接头adapter ；

5. T4-DNA连接酶优于DNA 连接酶，提高酶浓度，延长反应时间。

基因工程表达系统的类型、各自特点。

以大肠杆菌为受体的基因工程制药的优势：

1. 全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架；

2. 基因克隆表达系统成熟完善；

3. 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定；

4. 被美国FDA 批准为安全的基因工程受体生物。

以大肠杆菌为受体的基因工程制药的劣势：

1. 缺乏对真核生物蛋白质的复性功能；

2. 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统；

3. 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白；

4. 细胞周质内含有种类繁多的内毒素。

以酵母菌为受体的基因工程制药的优势：

1. 全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便；

2. 具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统；

3. 大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉；

4. 能将外源基因表达产物分泌至培养基中；

5. 不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA 认定为安全的基因工程受体系统；

6. 酵母菌是最简单的真核模式生物。

以哺乳动物（中国仓鼠卵巢细胞）为受体的基因工程制药的优势：

1. 遗传背景清楚，生理代谢稳定；

2. 与人的亲缘关系接近，外源蛋白修饰准确；

3. 基因转移和载体表达系统完善；

4. 耐受剪切力，便于大规模培养；

5. 被美国FDA 确认为安全的基因工程受体细胞。

以高等植物为受体的基因工程制药：

1. 无需特殊的专业知识以及特殊的贮藏条件；

2. 无需昂贵的生产培养基；

3. 生产力高，养殖简单，繁殖快，无需保证无菌的生产条件；

4. 植物能将药物（如疫苗）贮藏在种子中，可简单方便地生产、贮藏和发放疫苗；

5. 疫苗也在水果蔬菜中表达；

6. 可大规模生产某种蛋白；

7. 现代机械化农业能够有效地收割和加工大量的植物材料；

8. 表达产物无毒性和副作用，无残存ＤＮＡ和潜在致病、致癌性。

基因工程药物类型、特点、发展趋势。

类型：激素与多肽类、酶类、疫苗和单克隆抗体。

特点：多为大分子，分子结构复杂，治疗针对性强，疗效高，稳定性差，基因稳定性非常重要，具有免疫原性，体内半衰期短，多效性及网络效应，检验的特殊性。

发展趋势：1、走向海洋、走向宇宙空间；2、基因工程药物研究；3、后基因组研究；4、植物基因组研究；5、脑与思维；6、分子生物电子学的兴起；7、生物滤膜与环境净化；8、基因治疗。

动物细胞体外培养的特点、应用。

特点：1、动物细胞生长缓慢，培养时间长；2、更易受微生物污染 （包括细菌、真菌、病毒、支原体）， 需要防治污染问题；3、对培养环境的适应性差，对环境极其敏感，包括pH 值、温度、剪切力；4、对营养要求高，除了氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，一般还需要血清；5、原代细胞一般繁殖50代左右退化死亡。

应用：1、病毒疫苗，如乙肝、甲肝、口蹄疫、脊髓灰质炎和狂犬疫苗等；2、非抗体免疫调节剂，如干扰素、白细胞介质、B 细胞生长因子、巨噬细胞激活因子、T 细胞替代因子等；3、多态生长因子，如神经、成纤维、表皮、血清生长因子等；4、酶类，如组织血纤维酶原激活剂；5、激素，如红细胞、促黄体生成素、促滤胞素等；6、肿瘤特异性抗原，如癌胚抗原；

7、单克隆抗体；8、病毒杀虫剂，如杆状病毒。

永久细胞系与体内恶性转变的细胞的相似之处。

1. 都能无限增殖；

2. 遗传物质发生变化；

3. 细胞核体积发生增大，细胞发生畸形，核胞质比失调；

4. 染色加深，胞质量异常；

5. 细胞大小、形态不等，失去极性，排列紊乱，有细胞团。

干细胞的概念、特点、类型、意义，多能干细胞的获取方法。

概念：具有自我更新以及产生分化细胞能力的增殖性细胞。

特点：具有自我维持与自我更新的能力，具有多方向分化的潜能，分裂能力可维持相当长的时间，有的可保持终生，如肠粘膜干细胞既具有生理性的更新能力，也具有对损伤与疾病导致的反应与修复能力，如皮肤间质干细胞。

类型：按分化潜能分为，全能干细胞、万能干细胞、多能干细胞、专能干细胞；按发育阶段分为，胚胎干细胞、成体干细胞。

意义：可应用于，基因功能治疗，细胞治疗，组织工程，克隆生命，器官移植，药物筛选，发育研究。

多能干细胞获取方法：从人类胚胎的囊胚期内细胞群中直接分离多能干细胞（IVF 临床实验室得到胚胎）；从终止妊娠的胎儿组织中分离出多能性干细胞；核转移（SCNT ）；利用皮肤细胞诱发成多能干细胞。

单克隆抗体的制备方案、应用、发展趋势。

制备方案：1、材料准备；2、免疫操作；3、免疫脾细胞的收获；4、细胞融合；5、杂交瘤细胞筛选、鉴定与选择性培养；6、单克隆抗体的筛选、检测与鉴定；7、杂交瘤细胞的克隆化技术。

应用：细胞免疫学、免疫组织化学、微生物学、寄生虫学、肿瘤基础研究及临床诊治、生物治疗的导向武器 。

发展趋势：癌症方面，结肠癌、乳腺癌、B 细胞淋巴瘤、小细胞肺癌；免疫性疾病方面，类风湿关节炎、强直性脊柱炎、银屑病、CROHN 氏病；感染性疾病方面，菌血症、病毒性感染、儿童呼吸道融合病毒感染；器官移植及心血管疾病等的治疗方面迅速发展。 天然产物的定义、提高植物细胞次生代谢产物的途径。

天然产物的定义：动物、植物、昆虫、海洋生物和微生物体内的组成成分或其代谢产物以及人和动物体内众多内源性的化学成分的统称。

提高细胞次生代谢产物的途径：1、明确植物细胞生长与产物合成的关系；2、选择适宜的起始材料；2、首先必须选择能够高效合成目的产物的植物种类；3、优化培养基；4、前体；5、激发子/诱导子。

蛋白质工程的定义、原理、蛋白质工程的主要研究方法。

定义：以蛋白质结构和功能的研究为基础，运用遗传工程的方法，借助计算机信息处理技术，从改变和合成基因入手，定向改造天然蛋白质或设计全新的蛋白质，使之具有特定的结构、性质和功能，更好地为人类服务。

原理：遗传密码的通用性，碱基配对原则，计算机信息处理技术，精确高效的定点突变技术 方法：蛋白质一级结构分析方法，氨基酸序列的测定；蛋白质构象研究方法，单晶体衍射法和核磁共振（NMR ）法；蛋白质折叠过程研究方法；反向生物学技术，通过计算机设计，预测蛋白质空间结构和生物学功能；分子生物学相关方法。

发酵工程常用菌种类型、意义。

常用菌种类型分三大类：1、真核生物，如原生动物、单细胞藻类、真菌等；2、原核生物，如细菌、蓝绿藻、放线菌等；3、生物工程菌。

意义：抗生素发酵生产，氨基酸发酵生产，维生素发酵生产，系列轻工业产品。 发酵工程菌种选育方法。

1. 自然选育；

2. 诱变育种；

3. 营养缺陷型的筛选；

4. 抗性突变株的筛选；

5. 免疫激活剂产生菌的筛选；

6. 酶产生菌的筛选；

7. 抗反馈抑制变异株的筛选；

8. 抗分解代谢阻遏突变株的筛选。

酶的生产方法有哪些？

1. 提取法；

2. 发酵法；

3. 化学合成法。

简述酶的提取和精制的方法及原理。

酶的提取方法：稀盐溶液抽提，稀酸溶液抽提，稀碱溶液抽提，有机溶剂抽提，双液相体系萃取。

酶的精制方法：1、透析与超滤技术；2、层析分离技术，包括吸附层析技术、离子交换层析技术、凝胶层析技术、亲和层析；3、电泳分离技术，包括凝胶电泳技术、等电聚焦电泳技术。

原理：酶提取时应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱，稀盐酸等溶液进行提取，有些酶与脂质结合或含较多的非极性基团，则可

用有机溶剂进行提取。提高温度，降低溶液粘度，增加扩散面积。缩短扩散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。酶的精制则是根据蛋白质的分子大小，蛋白质的溶解度所带电荷吸附性质和对配体分子的亲和力来进行分离纯化。 酶分子改造和修饰的方法及原理

方法：1、金属离子置换修饰；2、大分子结合修饰；3、侧链水解修饰；4、侧链基团修饰；

5、酶基因与改造；6、酶分子的物理修饰。

原理：通过化学基团的引入或除去，使蛋白质共价结构发生改变，从而改变酶的某些特性和功能的过程。

酶的固定化方法及意义。

方法：载体结合法、离子交换吸附法、共价偶联法、交联法、螯合法、包埋法和热处理法等。 意义：1、稳定性增加；2、可反复使用；3、利于连续操作；4、易于和反应产物分离。