生化技术重点1
六年级 记叙文 13490字 318人浏览 Oo北海小龙oO

1、 紫外-可见光分光光度法在有机化合物中的应用,多数都是建立在π→π*和n →π*跃迁的基础上。π→π*跃迁与n →π*跃迁的重要区别①摩尔吸光系数不同:π→π*摩尔吸光系数在104左右,n →n*跃迁的摩尔吸光系数小,在10-100范围②溶剂的极性对这两种跃迁的吸收峰波长影响不同(溶剂效应):溶剂极性增加时,π→π*红移,n →π*蓝移。

2、 原子吸收分光光度法与紫外可见分光光度法的比较

本质:原子吸收/分子吸收;谱带:线状光谱/带状光谱;光源:锐线光源/连续光源;被测物状态:原子状态原子蒸气/分子状态、溶液;仪器结构:分光系统在原子化器之后/分光系统在比色杯之前;温度:高温/常温

3、离子选择性电极的一般作用原理:当电极置于溶液中时,电极膜与溶液界面的离子交换和扩散作用,改变两相界面原有电荷分布形成双电层产生膜电位;因参比电极电位固定,所以ISE 只随溶液中待测离子活度或浓度变化而变化。

4、简述聚丙烯酰胺凝胶电泳的优点

1具有分子筛作用,分离效果好

2设备简单,样品用量少,不易扩散,分辨率高

3不带电荷,几乎没有电渗作用

4可通过控制凝胶浓度来调整凝胶的孔径,以适合不同分子量样品的分离

5化学稳定性好,由于分子结构中富含酰胺基,聚丙烯酰胺凝胶是一种稳定的亲水胶体 6机械性强度好,有弹性,无色透明,易观察,可用检测仪直接测定。

5、高效液相层析法HPLC 与气相色谱法GC 的比较

a 共同点:①色谱的基本理论一致②定性定量原理完全一样③自动化程度高

b 流动相差别:GC 用气体做流动相,气体与样品分子之间作用力可忽略,载气种类少性质相近,改变载气对柱效和分离效率影响小;HPLC 以液体做流动相,液体分子与样品分子之间作用力不可忽略,液体种类多性质差别大,是控制柱效和分离效率的重要因素之一,使HPLC 除了固定相的选择外增加了一个可供选择的重要操作参数

c 固定相差别

d 使用范围更广。GC 一般分析沸点500c 以下,相对分子量少于450的物质,而对热稳定性差易于分解变性及具有生理活性的物质都不能用升温气化的方法分析。HPLC 在室温或接近室温的条件下工作,可分析沸点在500c 以上相对分子质量在450以上的有机物质,范围远远超过GC 。

E 原理和结构差别。

7、如何选择内标物?内标法优缺点。

对内标物的要求是纯度高,结构与待测组分相似。内标峰要与组分峰靠近但能很好分离,内标物和被测组分的浓度相接近。

内标法的优点是定量准确测定条件不受操作条件、进样量及不同操作者进学技术的影响。缺点是选择合适的内标物较困难,每次需准确称量内标物和样品增加了色谱分离条件的难度。

8、何为层析技术?如何分类?

概念:基于物质的物理化学和生物学特征的不同,在某种介质中的移动速度不同进而对物质进行分离和分析的技术,即层析技术

分类:①按流动相和固定相的状态分类:液相层析法、气相层析法②按层析法分离原理分类:分配层析法、吸附层析法、亲和层析法、凝胶层析法、离子交换层析法③按操作方式不同分类:纸层析法、薄膜层析法、薄层层析法、柱层析法

9、米氏常数在酶学分析中的意义?

km 是酶极为重要的动力学参数。意义:1鉴别酶的最适底物2由于存在km 值不同而功能相同的酶从而发现同工酶3判断细胞内酶的活性是否受底物抑制4测定不同抑制剂对某个酶km 及Vmax 的影响可以区别该抑制剂是竞争性抑制剂还是非竞争性抑制剂5已知某个酶的km ,可以计算出某个底物浓度时。其反应速度相当于最大速度的分数6利用工具酶来测定体液中某一成分的浓度或某一种酶活力时,可以根据衍生出来的公式计算工具酶所需要的活力单位7设计适宜的底物浓度。

10、何谓酶活性测定的固定时间法和连续监测法?各有何优缺点?

固定时间法:测定酶反应开始后某一时间内产物或底物浓度的总变化量来求取酶反应初速度的方法。优点:简单因最后测定产物时酶反应已经终止,故分光光度计可无需保温装置,显色剂的选择也可以不考虑对酶活力的影响。缺点:因为不用预实验确定,无法了解酶作用的这段时间内是否都是零级反应,难保证测定结果的真实性。

连续监测法:酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间的变化来求出酶反应速度的方法。优点:可将多点的测定结果连接成线,很容易找到成直线的区段,可以观察到是否偏离零级反应可选择线性反应期来计算酶活力,不需要终止反应。缺点:对仪器要求高,PH 和底物对反应有影响,仪器要恒温。

11、酶偶联测定中常用指示酶?常检测的指示反应?

利用氧化还原酶反应原理连接到NAD(P)+-NAD(P)H的反应后直接通过分光光度法或其他方法测定NAD(P)H的变化量。1、NAD(P)+或NAD(P)H偶联的脱氢酶及其指示反应,这类方法基于NADH 或NADPH 在340nm 处有特征性的吸收峰而NAD+或NADP+在300和400nm 之间没有吸收峰。2、偶联H2O2的工具酶及其指示反应。反应生成红色醌亚胺化合物,在500nm 处有最大吸收峰 2H2O2+酚+4-AAP→红色醌亚胺化合物+4H2O

12、简述标本溶血对临床生化测定的影响及防止方法?

影响:使检测项目的结果分析变得更加复杂,这是在超微量高精度和多指标的检测分析中显然不可忽视。

方法:注射器和容器要干净,抽血时使用的针头不要过小,抽血用力不要过大,不要较长时间使用止血带,不要产生过多泡沫,抽血后应取下针头再将血液注入容器,混匀抗凝剂时用力不要过大等

13、溶血对生化试验的干扰机理:一是血细胞中高浓度组分逸出,使测定结果增高,二是血细胞成分进入血清后因化学反应而引起其他物质的浓度改变,三是血红蛋白本身颜色对检测的光学干扰。

14、系统误差SE

在相同的条件下,多次测量同一量值时,误差的大小和正负保持不变,或在测量条件改变时按一定规律变化的误差。①特点:为可测误差;可纠正;具有单向性,没随机性,不服从正态分布规律,通过增加测量次数不能消除。②原因-方法/理论误差、仪器误差、试剂误差、操作误差。③表现形式:a 比例系统误差(线性系统误差)-与被测物浓度有相同百分比的误差,随被测物浓度的变化成比例变化;b 恒定系统误差-是由某种干扰物引起的、使测定结果恒定的偏向一方、增高或减少的量相同的误差。④纠正方法:减小方法的误差;做空白试验;使用标准化的试剂和标准品;严格控制实验条件;注意仪器校正。

15、随机误差RE

在同一测试条件下,多次重复测量同一量值时,误差的大小和正负均以不可预知的方法变化着的误差。①特点:数据呈正态分布;不可预测不易控制;通过增加测量次数可减小;小误差出现机会多,大误差出现机会较少;分析步骤越多,此类误差出现机会越大。②原因:偶然因素③纠正方法:检验人员严格按照操作规程操作;多次取样;实验前认真检查仪器的分析性能。

16、临床生化方法学分级的依据是什么?如何进行分级?各自用途?

根据分析方法的准确度与精密度的不同,将实验方法分为决定性方法,参考方法和常规方法。决定性方法:用于发展及评价参考方法和一级标准品。参考方法:应用于鉴定常规方法,评价其误差大小,干扰因素,并决定其是否可以被接受,也用于鉴定二级标准品,为质控血清定值,评价商品试剂盒等。常规方法:作为推荐方法。

17、以光度法为例,简述临床生化方法的建立需考虑的因素

①方法建立原理的确定:根据技术原理和被测物质的物理化学性质来确定其方法建立的原理 ②方法建立时条件选择:测定颜色产物的吸光系数—λmax ;测定方法适用的浓度范围—选择直线段浓度范围进行稳定性试验;影响颜色反应的因素—pH 、杂志、反映的温度和时间、试剂组分浓度

18、各个评价试验

①重复性试验。目的:检测候选方法的随机误差(精密度)方法:批内重复性试验、天内重复性试验、天间重复性试验

②回收试验。目的:所谓回收即分析方法正确测定加入常规分析样品中的纯分析物的能力。目的是检测候选方法的比例系统误差。方法:将被分析物的纯品标准液加入病人样品中成为分析样品院病人样品加入等量的无分析物的溶剂作为基础样品然后用候选方法测定,两者测定结果的差值为回收量

③干扰试验。目的:测定候选方法的恒定系统误差。方法:将可能引起干扰的物质配成一定浓度的溶液加到病人样品中称为分析样品,原病人样品加入等量的无干扰物的溶剂作基础样品然后用候选方法测定,两者之差即干扰值表示该干扰物引起的误差

④方法比较试验。目的:检测候选方法的系统分析误差。方法:对一组病人的标本用候选方法和对比方法同时进行分析测定最后观察两者之间的差异。数据统计的处理:方法作散点图、进行直线回归分析、作相关分析、配对资料t 检验

19、何谓临床特异度、灵敏度?都有那些用途?

临床特异度又称真阴性率,指在非患病者中,用该诊断试验检查,得到阴性结果的百分率。用途:1拟诊某患者有某疾病的概率较大时,便于确诊2拟诊疾病严重且疗效预后均不好的疾病,以防误诊,尽早解除病人的压力3拟诊疾病严重且根治方法有较大损害时,需确诊以免造成患者不必要的损害。

临床灵敏度又称真阳性率,指在患病者中,用该诊断试验检查,得到阳性结果的百分率。用途:1拟诊为严重但疗效好的疾病,以防漏诊2拟诊为有一定治疗效果的恶性肿瘤,以便早期确诊,及时治疗3存在多种可能疾病的诊断,可排除某一诊断4普查或定期健康体检能筛选某一疾病以防漏诊。

20、临床诊断试验技术性能评价和诊断性能评价的区别?

技术性能评价是评价方法或技术的精密度、准确性、特异性、分析范围等即方法学评价,其解决的是方法本身的问题;诊断性能评价是基于有关流行病学的调查为基础,对某种疾病的诊断方法进行评价的临床试验。即评价该诊断试验的临床灵敏度、临床特异性、预测值、似然比等。

21、全面质量控制

全面质量控制主要包括一)标本分析前的质量保证:主要内容为①检验人员的培训;实验室的设置和工作环境;实验仪器的质量保证;检测方法的选择和评价;实际和标准品的选择与评价;病人准备;标本的采集处理贮存和转运;实验室用水。二)分析中的质量控制:主要内容建立标准化的操作规程;室内质控和结果分析;登记和填发报表。三)分析后的质量评估:主要内容送发实验报告;室内质控的数据管理;参加室间质量评价;病人投诉的调查;临床信息反馈。

22、室内、室间质量控制的概念、目的

室内质量控制IQC :是由实验室的工作人员采用一系列统计学的方法连续评价本实验室测定工作是否稳定,判断检验报告是否可发出的过程。目的-检测、控制本实验室测定工作的精密度(监测测定过程是否稳定)并监测其准确度的改变,以提高常规检测结果的一致性。 室间质量评价EQA :是多家实验室分析同一样本

目的:通过实验室间的对比,观察各实验室测定结果的准确性,一致性,并采取一定措施使各实验室结果趋向一致,,为实验室认可提供客观依据。

23、简述ROC 曲线的制作方法及其主要作用?

ROC 曲线的绘制方法:对疾病组和参照组测定结果进行分析、确定测定值的上下限、组距及截断点,按选择的组距间隔列累计频数分布表,计算出所有截断点的敏感性、特异性,以敏感性为纵坐标代表阳性率,(1-特异性)为横坐标作图。

ROC 曲线的主要作用:选择最佳的诊断界限值,两种或两种以上不同诊断试验对同种疾病诊断可靠性的比较。

24、Monica 质控图的优点

①制作简单,应用方便②形象直观,又容易理解和掌握。③Monica 质控图采用统一CCV 作为允许误差来确定警告线和最大允许线的界限值,能将临床生化常规项目的室内控制与室间质评有机地联系起来,从室内质控图上,即可基本预测参加室间质评可能获得的变异指数得分情况,更能充分发挥室内控制与室间质控二者之间相互补充,相互促进的作用。

1光谱分析技术:指利用各种化学物质(包括原子、基团、分子及高分子化合物)具有吸收、发射或散射光谱谱系的特点,对物质进行定性或定量分析的技术。①分类:根据光谱谱系特征分为吸收光谱分析、发射光谱分析和散射光谱分析。②特点:灵敏度高、精密度和准确度高、选择性较高、仪器设备简单、操作易掌握、用途广泛等。

2光的本质是不连续的微粒性和连续的波动性矛盾的对立和统一,即光的波粒二象性。 3可采用钨灯做可见光分光光度计的光源(350-2500nm );氢灯可作为紫外分光光度计的光源(185-400nm )。

4分子能级是电子能级、振动能级和转动能级之和。

5吸收光谱曲线(吸收光谱):当一定光源所产生的电磁波通过液态、气态或固态物质时,物质的原子或分子对电磁波进行选择性吸收,从而产生原子吸收光谱或分子吸收光谱;被吸收的光谱称为该物质的吸收光谱。根据其形状和λmax 可进行定性分析;定量分析用λmax 作测定的波长。

6跃迁所需能量σ→σ*>n →σ*>π→π*> n →π*。紫外及可见光分光光度法在有机化合物中的应用,多数都是建立在π→π*和n →π*跃迁的基础上。π→π*跃迁与n →π*跃迁的重要区别①摩尔吸光系数不同:π→π*摩尔吸光系数在104左右,n →n*跃迁的摩尔吸光系数小,在10-100范围②溶剂的极性对这两种跃迁的吸收峰波长影响不同(溶剂效应):溶剂极性增加时,π→π*红移,n →π*蓝移。

7透光率/透光度T :透过光的强度It 与入射光的强度Io 之比,T=It/Io。

光的吸收定律(朗伯—比尔定律):一束平行的单色光通过稀溶液时,溶液的吸光度与溶液浓度及液层厚度的乘积呈正比A=kcl。

8分光光度计都是由光源、单色器、比色杯、检测器和显示器五大部件组成。

9紫外可见分光光度法常用的单组分定量方法有吸光系数法、标准曲线法和标准对比法。多组分定量方法有解联立方程法和双波长分光光度法。

10显色剂:用来使被测物质显色、生成有色化合物的试剂。选择原则-入射光波长吸收最大干扰最小;吸光度0.2-0.8;狭缝宽度为吸收峰半宽度的1/10。显色反应:将试样中被测组分转变为在一定波长范围内有吸收或吸收加大的有色化合物的化学反应。

11原子吸收分光光度法:是基于光源发射的待测元素的特征光波通过样品蒸气时,被蒸气中待测元素基态原子吸收,由辐射光波强度的减弱程度以求得样品中待测元素含量的一种分析技术。

12共振线:电子从基态跃迁能量最低的激发态(第一激发态)时要吸收一定频率的光,当它再回到基态时则发射出同样频率的光(谱线),这种谱线称为共振发射线。使电子从基态跃迁至第一激发态所产生的吸收谱线称为共振吸收线。共振线特点-具特征性、较灵敏。 13峰值吸收系数Ko :如用Kv 对波长λo 或频率vo 来作图,则在波长或频率处有一最大值,称Ko 。半宽度Δν:在峰值吸收系数的一半Ko/2处吸收线上两点间的距离。中心频率νo :吸收系统极大值对应的频率称中心频率。

14原子吸收分析中,发射线宽度主要受热变宽和自然变宽影响;吸收线宽度主要受热变宽和压力变宽影响。

15原子吸收分光光度计由光源、原子化器、分光系统和检测系统四个部分组成。原子吸收定量分析中,常用的方法是标准曲线法和标准加入法。

16荧光光度分析法:有些物质的分子吸收能量后能发生荧光根据所发生荧光的特性及强度,对物质进行定性或定量分析的方法。

17荧光光谱:固定激发光的波长,用单色器将发射的荧光分光,记录每一波长下的荧光强度,以荧光强度为纵坐标,荧光波长为横坐标作图,就可得到物质的荧光光谱。激发光谱和荧光光谱的关系是相对称呈镜像关系。

18荧光效率Φ:表示物质产生荧光的能力,指激发态分子发射荧光的光子数与基态分子吸收激发光的光子数之比。当Io 一定且浓度很稀时,荧光强度与荧光物质浓度成正比。 19荧光光度法定量分析中,常用的方法是标准对比法和标准曲线法。

20火焰光度法:是待测元素利用火焰作为激发光进行分析的方法,属原子发射光谱分析一种。定量分析依据-在一定条件下,溶液的浓度和发射光的强度成正比。定量分析方法有标准曲线法和标准加入法。

21比浊法的突出问题是颗粒的大小对浊度和浊度曲线有较大影响。因此,在比浊法中必须力求做到:混悬液中颗粒的大小应尽可能相同,并易重复;标准管和测定管中颗粒大小也应力求一致。混悬液在一定时间内,至少在10分钟内应维持稳定,也就是颗粒应该不易相互聚集、变大变粗。

1电泳技术:利用各种带电粒子电泳速度不同,对物质进行分离,然后对物质进行定性和定量的分析方法。①分类:按照电场强度的不同,可将电泳技术分为常压电泳和高压电泳。按照电泳媒介不同,可将电泳技术分为自由电泳和区带电泳。按分离目的不同,分为分析电泳和制备电泳。按支持物的装置形式不同,分为水平电泳和垂直电泳。按缓冲液pH 是否均一分为连续和不连续pH 电泳。(区带电泳根据支持介质的不同又分为滤纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳)②特点:凡是带电物质均可应用某一电泳技术分离,并可进行定性定量分析;分辨率高;可在常温下进行;样品用量少;操作省时简便;设备简单。

2电泳迁移率μ指在单位电场强度下,带电粒子的移动速度;是物质的特征常数;μ=V/E。①一般来说,粒子所带的净电荷愈多,粒子的直径愈小、愈接近球形,则在电场中的电泳速度愈快。②影响因素:与所带电荷成正比,与其半径及介质粘度系数成反比;还与电场强度,电泳缓冲液的化学组成、pH 值、离子强度,支持介质的电渗作用和吸附作用,分子的性质和形状,蒸发有关。

3电渗作用:液体在电场中对于一个固体支持物的相对移动。

4聚丙烯酰胺凝胶电泳的优点:具有分子筛作用,分离效果好;样品用量少,设备简单,不易扩散,分辨率高;不带电荷,几乎无电渗作用;可通过控制凝胶浓度控制调节凝胶的孔径;

化学稳定性好;机械强度好,有弹性,无色透明易观察,可用检测仪直接测定。 5聚丙烯酰胺凝胶的孔径在很大程度上由凝胶总浓度T 和交联度C 决定。

6不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率高是因为它具有浓缩、电荷和分子筛三种效应。

7等电聚焦电泳的优点:分辨率很高(等电点差0.01pH 蛋白质分开);区带清晰无拖尾;蛋白质可保持原有活性,分离速度快;电泳结束后可直接测定蛋白质的等电点。

1电化学分析技术:利用物质的电化学性质(电位、电流、电导或电量等)来测定物质含量的分析方法。

2电位分析法:利用电极电位和浓度的关系来测定被测物质浓度的一种电化学分析法。 3电化学电池两个必备条件-两个电极和电解质溶液。指示电极是电位随待测离子浓度而变化,能指示待测离子的浓度的电极。参比电极是电位恒定,不受试液组成变化的影响的电极。 4离子选择性电极的一般作用原理:当电极置于溶液中时,电极膜与溶液界面的离子交换和扩散作用,改变两相界面原有电荷分布形成双电层产生膜电位;因参比电极电位固定,所以ISE 只随溶液中待测离子活度或浓度变化而变化。

5离子选择性电极分类:分为基本(原)电极和敏化电极。前者分为晶体(膜)电极(分为均相膜电极和非均相膜电极)和非晶体(膜) 电极(刚性基质电极和流动载体电极),后者分为气敏电极和酶电极。

6玻璃膜电极属于刚性基质电极。

7离子选择电极分析法的分析仪器:一般由信号发生器,检测器,信号处理器和显示器四部分组成。

7离子选择电极分析法的分析方法有标准曲线法、标准比较法、标准加入法。

1层析技术原理:层析是利用待分离的样品组分在两相中分配的差异而实现分离的;这个过程可以形象地看作是固定相对样品中各组分随流动相移动所产生的流动阻力不同,阻力小的组分跑得快,阻力大的组分跑得慢。经过一段距离后,各组分就可以分开了。

2层析技术分类:按分离原理分为分配层析法、吸附层析法、离子交换、凝胶、亲和层析法;按固定相和流动相所处状态分为气液、气固、液液、液固层析法;按操作形式不同分为纸层析法、薄膜、薄层、柱层析法。

3色谱图中的重要参数:峰高H 和区域宽度(峰高H-定量分析依据);峰宽W/Y;半峰宽W1/2/Y1/2;标准偏差σ;保留值-描述在层析图上位置,定性依据,包括死时间tM 、保留时间tR 、校正保留时间tR 、死体积VRo 、保留体积VR 、校正保留体积VR`。

4色谱分离中参数:相对保留值α;分配系数K ;分配比k`;相比β;塔板数N ;分离度R 。(k`决定洗出峰位置,分离度与理论塔板数N 的平方成正比;α决定洗出峰位置)

5高效液相层析法HPLC 与经典液相色谱法比较异同:同-色谱的基本理论一致;定性定量原理一致;均可用计算机控制色谱操作条件和色谱数据的处理程序,自动化程度高。经典与高效异-原理和结构-常压或减压,高压;流动相区别-气体,液体;固定相-有机物组成的液体固定相,固体吸附剂;适用范围-500℃以下相对分子质量<450,广;填料颗粒-大,小;柱效-低,高;分析速度-慢,快;色谱柱-只可用一次,可重复使用;在线检测-不能,能。 6梯度洗脱:按照事先设置的时间程序改变流动相的流速或组成来达到提高分离度改善分离结果的方法。包括流量和溶剂梯度洗脱。

7色谱的定量分析①理论依据-在一定操作条件下,被分析物质的质量mi 与检测器上产生的响应信号(色谱图上表现为峰面积Ai 或峰高hi )成正比(校正因子f,m=fA)。②方法有归一化法;外标法/标准样校正法/标准曲线法;内标法;内加标准法;还有内标标准曲线法、转化定量法、收集定量法等。

1离心技术:根据颗粒在做匀速圆周运动是受到一个外向的离心力的作用,从而使某些颗粒达到浓缩或与其他颗粒分离的目的而发展起来的一种分离技术。离心力Fc=mω2r 。

2只要相对离心力RCF 不变,一个样品可以在不同离心机上获得相同的结果。

3沉降系数S 物理意义-颗粒在离心力作用下从静止状态达到极限速度所经过的时间。当生物高分子或亚细胞结构的化学组成或分子量不了解时,常用沉降系数来描述其结构基础,如

1.6S 、23S 和70S 核蛋白体RNA 等。

4沉降速度:在离心力场的作用下,单位时间内物质的运动的距离。

5离心方法可分为三类:平衡离心法、等密度离心法、经典式沉降平衡离心法。

6差速离心法对时间有严格要求。

1自动生化分析仪:是将生物化学分析过程中的取样、加试剂、去干扰物、混合、保温反应、自动监测、数据处理、打印报告以及实验后的清洗等步骤自动化的仪器。

2自动生化分析仪分类:根据仪器反应装置结构不同,可分为连续流动式、离心式、分立式和干片式。根据仪器的功能及复杂程度,可分为小型、中型、大型及超大型。根据同时可测定项目数量不同,可分为单通道和多通道。根据自动化程度不同,可分为全自动化和半自动化。

3连续流动式自动生化分析仪/管道式分析仪:第一代自动分析仪;结构为样品盘、比例泵、混合器、透析器、恒温器、检测装置等。

4自动生化分析仪常用的分光系统主要有前分光和后分光。全自动生化分析仪多采用后分光。分光装置有干涉滤光片或光栅分光两类。自动生化分析仪多用37℃。

5自动生化分析仪常用分析方法:①终点分析法(平衡法)包括一点终点法、两点终点法/固定时间法、双波长法。②连续监测法:具体方法有两点速率法、多点速率法(最小二阶乘法、多点法、回归法、带速率时间法)。③比浊测定法④均相酶免疫测定法。

6自动生化分析仪参数设置包括样品与试剂量、测定方法、校正方法、反应时间、测定波长、控制因素等。

1米氏方程:V=Vmax[S]/(Km+[S]);米氏常数Km=(k2+k3)/k1。

2 Km是酶极为重要动力学参数,物理意义指ES 复合物消失速度(k2+k3)与形成速度k1之比;其数值为酶促反应达到最大反应速度一半时的底物浓度,即V=Vmax/2时,[S]=Km。

(1)意义:①鉴别酶的最适底物:Km 可表示酶与作用底物的亲和力-负相关②存在Km 值不同而功能相同的酶,从而发现同工酶③判断在细胞内酶的活性是否受底物抑制④测定不同抑制剂对某个酶Km 及Vmax 的影响,可以区别该抑制剂是竞争性抑制剂还是非竞争性抑制剂⑤已知某个酶的Km ,可计算出某一底物浓度时,其反应速度V 相当于Vmax 的分数⑥利用工具酶来测定体液中某一成分浓度或某一种酶的活力时,可依据米氏方程计算工具酶所需活力单位⑦设计适宜的底物浓度。

(2)Km 的测定—常用双倒数作图法:1/V=Km/Vmax×1/[S]+1/Vmax;在1/V轴上截距是1/Vmax,在1/[S]轴上截距是-1/Km,斜率Km/Vmax。

3 Vmax不是酶的特征常数。当[S]无限大时,Vmax=k3[E0],可得k3= Vmax/[E0];k3(酶的转换率/转换数) 为一级速度常数,表示单位时间内每个酶分子或每一活性部位催化的反应次数。单底物反应中,用kcat 表示,越大催化效率越高,一般在1-104/s范围。

1酶活力:指在规定条件下单位时间内底物的减少量或产物的生成量,即通过测定酶促反应速率来测定。

2酶活力单位:是衡量酶活力大小的尺度,它反映在某一个特定的条件下,使酶促反应达到某一速度时所需要的酶量,而速度即指单位时间内反应物的变化量。三种表达-惯用单位、国际单位和katal 单位。(1IU 指在规定条件下每分钟催化1umol 底物转化成产物所需要的酶量;1katal 指规定条件下每秒钟使1mol 底物转化为产物所需的酶量=60×106IU )

3酶促反应时间进程:两期-零级和一级反应期;三阶段-延滞期、线性期、偏离线性期。酶浓度[E]与反应产物浓度[P]或底物浓度[S]的变化成正比。[E]越大,线性范围越短;如果[E]相

同,[E]越小线性反应期也越短。

4酶活力测定方法:原则-在零级反应期测定即v=Vm=常数,或-[S]或[P]与反应时间t 成正比;反应速度与酶量呈线性关系。按照反应时间可分为定时法和连续监测法。

5工具酶:在酶学分析中,作为试剂用于测定化合物浓度或酶活力的酶。常用的指示反应:NAD(P)+或NAD(P)H偶联的脱氢酶及其指示反应,偶联H2O2的工具酶及其指示反应。 6酶偶联分析法-用过量、高度专一的偶联工具酶,使被测酶反应能继续进行到某一直接、连续、简便、准确测定的阶段,间接地测出第一个酶促反应中待测物的浓度或待测酶的活力。 7应用酶作为工具可对酶的底物、辅酶、激活剂或抑制剂进行定量分析,常用方法有终点法和动力学法。

8酶活性测定最适条件选择:底物、pH 值、温度、辅助因子、样品、空白和对照等。

1同工酶:指催化相同的化学反应,但酶分子的分子组成、空间构象、理化性质及生物学性质不同的一组酶。

2同工酶分离鉴定常用方法-电泳法、层析法、免疫法、动力学法、热失活法。

常用的电泳法有聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、琼脂糖凝胶电泳、醋酸纤维素薄膜电泳。电泳测定步骤-区带分离、酶带显示、区带定量。

1临床生物化学检验常用标本有血液、尿液、脑脊液、胸水、腹水、浆膜腔积液等。

2溶血对生化试验的干扰机理:一是血细胞中高浓度组分逸出,使测定结果增高,二是血细胞成分进入血清后因化学反应而引起其他物质的浓度改变,三是血红蛋白本身颜色对检测的光学干扰。

3血清与血浆区别主要在于血清不含有纤维蛋白原。

4常用防腐剂-浓盐酸、甲苯、冰醋酸和麝香草酚。

1系统误差SE :在相同的条件下,多次测量同一量值时,误差的大小和正负保持不变,或在测量条件改变时按一定规律变化的误差。①特点:为可测误差;可纠正;具有单向性,没随机性,不服从正态分布规律,通过增加测量次数不能消除。②原因-方法/理论误差、仪器误差、试剂误差、操作误差。③表现形式:a 比例系统误差(线性系统误差)-与被测物浓度有相同百分比的误差,随被测物浓度的变化成比例变化;b 恒定系统误差-是由某种干扰物引起的、使测定结果恒定的偏向一方、增高或减少的量相同的误差。④纠正方法:减小方法的误差;做空白试验;使用标准化的试剂和标准品;严格控制实验条件;注意仪器校正。 2随机误差RE :在同一测试条件下,多次重复测量同一量值时,误差的大小和正负均以不可预知的方法变化着的误差。①特点:数据呈正态分布;不可预测不易控制;通过增加测量次数可减小;小误差出现机会多,大误差出现机会较少;分析步骤越多,此类误差出现机会越大。②原因:偶然因素③纠正方法:检验人员严格按照操作规程操作;多次取样;实验前认真检查仪器的分析性能。

3准确度:是指测量值与真值符合的程度;大小主要取决于系统误差。精密度:指同一标本在一定条件下多次重复测定,各结果间相互符合的程度;大小主要决定于随机误差。

4根据分析方法的准确度与精密度的不同,将临床生化实验方法分为决定性方法、参考方法、常规方法三级。①决定性方法:指准确度最高,系统误差最小,经过详细的研究,没有发现产生误差的原因或在某些方面不够明确的方法,测定结果为确定值,与真值最接近。用于发展及评价参考方法和一级标准品。②参考方法:指标准度和精密度已经充分证实的分析方法,干扰因素少、系统误差很小,与重复测定的随机误差相比可忽略不计,有适当的灵敏度、特异性、直线性及较宽的分析范围。主要应用于鉴定常规方法,评价其误差大小、干扰因素,并决定其是否可以被接受;也可用于鉴定二级标准品;也可用于评价商品试剂盒等。③常规方法:指方法的性能指标符合临床或其他目的需要,有适当的分析范围而且经济实用。可作为推荐方法。

5标准品/参考物分级①一级标准品(原级参考物)由决定性方法确定;用于发展及评价参考方法,校正决定性方法,并为二级标准品定值。②二级标准品(次级标准品)由参考方法定值或用与一级标准品比较而确定;用于常规方法的标化,制工作标准,为控制物定值。③控制物:用参考方法定值;用于质量控制。

6回收-即分析方法正确测定加入常规分析样品中的纯分析物的能力。回收试验目的:检测候选方法的比例系统误差,衡量其准确度。

7方法比较试验目的:检测候选方法的系统分析误差,包括比例和恒定系统误差。设计:对一组(40-100例)病人的标本用候选方法和对比方法同时进行分析测定,最后观察两者之间的差异。统计和分析:做散点图;进行直线回归分析;作相关分析;配对资料t 检验。 1金标准/确诊实验:指当前为临床医学界公认的、最可靠的诊断某种疾病的诊断方法。 2诊断灵敏度Sen/敏感度/真阳性率TPR :指在患病者中用该诊断试验检查得到阳性结果的百分率;反映诊断试验正确识别患者的能力。=真阳性TP/(真阳性TP+假阴性FN )×100%。 诊断特异度Spe/特异性/真阴性率TNR :指在非患病者中应用该诊断试验获得阴性结果的百分比;反映诊断试验正确鉴别非患病者的能力。=真阴性TN/(真阴性TN+假阳性FP) ×100%。 3阳性预测值PPV/+PV:在诊断试验结果为阳性的人数中,真正患病者所占的百分率,即试验结果阳性者属于真病例的概率。真阳性TP/(真阳性TP+假阳性FP )×100%。流行率越高,阳性预测值越高;当流行率一定诊断试验特异性越高,阳性预测值越准确。

阴性预测值NPV/-PV:在诊断试验结果为阴性的人数中,非患病者所占的百分率,即试验结果阴性者属于非病例的概率。真阴性TN/(真阴性TN+假阴性FN )×100%。当流行率一定诊断试验敏感性越高,则阴性预测值越高。

4似然比LR :验后概率较之验前概率的符合程度和变化方向取决于诊断试验的特性,表征这种特性的量化指标称似然比。

5分界值/阈值/临界值/鉴别值/指定值:指划分诊断试验结果正常与异常的界值。

1全面质量控制主要包括标本分析前的质量保证、分析中的质量控制和分析后的质量评估三个主要过程的质控。

2室内质量控制IQC :是由实验室的工作人员采用一系列统计学的方法连续评价本实验室测定工作是否稳定,判断检验报告是否可发出的过程。目的-检测、控制本实验室测定工作的精密度(监测测定过程是否稳定)并监测其准确度的改变,以提高常规检测结果的一致性。 3质控品应具有的特征:人血清基质, 或尽可能与人血清基质一致;无传染性;添加剂的数量少且尽可能纯;成分分布均匀,瓶间差小;冻干品复溶后成分稳定;实验室的有效期应在一年以上;合理的成本。

4室内质量控制的主要方法:将质控血清随机插入日常检验标本中一起测定,将质控血清的测定结果点在质控图上,当点子落在允许误差范围之内,一般意味着测定结果良好;若点子落在允许误差范围之外,提示测定结果有问题。

5最佳条件下变异OCV :是指实验室在目前条件下,该项目检测所能达到的最好精密度水平。常规条件下变异RCV :表示实验室在常规条件下,该项目检测所能达到的精密度水平。 6质控图:方法-在纵坐标上标出X 、X ±2S 、X ±3S 的标志, 并将其具体值标在左侧标尺上;画出均值线(X)、警告线(X±2S) 、失控线(X±3S) ;每天将该批号的质控血清按有关规定复溶,然后随同各项目病人标本的测定同时测定一份,将测定值点在图上的相应位置,直线将该点与前一天的点连接;月底计算当月全部质量控制血清检测结果的X 、S 和CV ,并进行图形分析和小结,将质量控制图存入质量控制资料档案。

7质控图异常表现:曲线漂移、趋势性变化、精密度的变化、失控。

8室间质量评价EQA 是多家实验室分析同一样本,由外部独立机构收集、分析和反馈实验室上报的结果,以评价实验室常规工作质量的过程。

9能力比对分析PT :是EQA 技术方案之一,是通过实验室之间的比对判断实验室检测能力的活动。