产酶条件优化方案
初一 记叙文 3364字 90人浏览 雨梦0225

滤纸条降解试验

吸取纤维素降解菌种子液1ml 接种到装有50ml 赫奇逊培养液的250ml 三角瓶中,瓶中放置1cm ×6cm 的新华Ⅰ号滤纸条,同时设置不加菌液的滤纸条作为对照,每个处理3个重复。置于30℃恒温摇床,200r/min振荡培养5d ,观察各瓶中滤纸条溃烂情况。

赫奇逊培养液:KH2PO4 1.0g MgSO4·7H2O 0.3g CaCl2 0.1g NaCl 0.1g

FeCl3 0.01g NaNO3 2.5g pH7.2~7.3 蒸馏水1000ml

纤维素酶活的测定

CMC 酶活测定

取培养好的发酵液于4000r/min的条件下离心15分钟,上清液即为粗酶液。分别加入相对应菌株的粗酶液1mL ,加入柠檬酸缓冲液1ml ,再加入0.8%的羧甲基纤维素钠溶液1.5mL ,震荡摇匀,将所有试管置于50℃的水浴锅中保温50min ,保温完成后取出试管,加入2mL DNS显色剂,震荡摇匀,将各试管置于沸水浴中水浴加热5min ,使DNS 显色剂与还原糖充分反应,5min 后取出试管用流水冷却,再用蒸馏水定容至20mL ,将各试管摇匀后以葡萄糖标准曲线1号管作为对照,依次测定各菌株在紫外分光光度计540nm 处的OD 值,计算出平均值后,参照葡萄糖标准曲线查出还原糖的量。

FPA 酶活测定

取培养好的发酵液于4000r/min的条件下离心15分钟,上清液即为粗酶液。分别加入相对应菌株的粗酶液1mL ,加入柠檬酸缓冲液1ml ,再加入滤纸(1cm ×6cm) 一条,震荡摇匀,将所有试管置于50℃的水浴锅中保温50min ,保温完成后取出试管,加入2mL DNS显色剂,震荡摇匀,将各试管置于沸水浴中水浴加热5min ,使DNS 显色剂与还原糖充分反应,5min 后取出试管用流水冷却,再用蒸馏水定容至20mL ,将各试管摇匀后以葡萄糖标准曲线1号管作为对照,依次测定各菌株在紫外分光光度计540nm 处的OD 值,计算出平均值后,参照葡萄糖标准曲线查出还原糖的量。

Avicel cellulase (Avicelase)

500 uL of enzyme mixed with 1mL of Avicel (1%, w/v) for determining the Avicelase activity. 详细见给你的那篇文献

通过以上两种方法,测得复筛得到的酶活高的菌株每 8 h 的粗酶酶活产酶曲线,测到72h 。确定酶活达到最大的最适时间。

产酶条件优化

研究不用培养温度、pH 值、碳源、氮源、接种量、装液量对菌株产酶的影响,并在各因子最适条件下培养菌株,检测其产酶酶活。(培养的时间均为酶活达到最大的最适时间) 培养时间:生长曲线和产酶曲线

1 培养温度对产酶的影响。

将复筛得到的酶活高的菌株分别接种于5个100 mL的羧甲基纤维素培养基中(用250mL 的三角瓶承装),并分别在 25、 30、 35、40、 45℃下培养,培养一定时间后,测定其CMC 酶活,从而确定菌株产酶的最适温度。

2 培养起始 pH 对产酶的影响。

将复筛得到的酶活高的菌株分别接种于5 个 100 mL 羧甲基纤维素培养基中,并将其起始 pH 值分别调至 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。培养一定时间后,测定其 CMC 酶活,从而确定菌株产酶的最适 pH 值。

3 不同碳源对产酶的影响。

分别以CMC-Na 、微晶纤维素、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、可溶性淀粉、麦麸、乳糖为

碳源代替基础培养基中的碳源,添加量均为10g/L ,培养纤维素降解菌。培养一定时间后,测定其 CMC 酶活,从而确定菌株产酶的最适碳源。然后添加不同浓度(20g/L、30g/L、40 g/L、50 g/L、60 g/L、70 g/L、80 g/L)的最适碳源代替基础培养基中的碳源,培养纤维素降解菌。培养一定时间后,测定其 CMC 酶活,从而确定菌株产酶的最适碳源的最适浓度。 4 不同氮源对产酶的影响。

分别以胰蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏、NH4 NO3、(NH4)2SO4、NH4Cl 、KNO3、NaNO3、尿素、大豆为氮源代替基础培养基中的氮源,添加量均为2g/L,培养菌株。培养一定时间后,测定其 CMC 酶活,从而确定菌株产酶的最适氮源。然后添加不同浓度(1 g/L、3g/L、5g/L、7g/L、9g/L、12g/L)的最适氮源代替基础培养基中的氮源,培养纤维素降解菌。培养一定时间后,测定其 CMC 酶活,从而确定菌株产酶的最适氮源的最适浓度。

5 不同接种量对产酶的影响。

将复筛得到的酶活高的菌株分别以不同的接种量(1%、2﹪、4﹪、6﹪、8﹪、10﹪) 接种于5个100 mL 的羧甲基纤维素培养基中,培养一定时间后,测定其 CMC 酶活,从而确定菌株产酶的最适接种量。

不同装液量对产酶的影响。

25mL/250mL、50mL/250mL、80mL/250mL、100mL/250mL、150mL/250mL

在最适条件下培养菌株

根据以上结果,配制以最适碳源,氮源的培养基,最适起始pH 值并在最适温度的条件下培养最适时间,测其酶活,做3个平行试验,取平均值。

注:培养基配方

羧甲基纤维素培养基:羧甲基纤维素钠 10g 、蛋白胨 10 g、Yeast extract(酵母浸粉)10 g、NaCl 5 g、K2HPO4 1 g、MgSO4·7H2O 0. 2 g、CaCl2 0.3 g,FeSO4·7H2O 5 mg,M nSO4 1.6 m g ,ZnCl2 1.7 m g,CoCl2 2 mg,pH 调至7. 2。

基础培养基:NaCl 5 g、K2HPO4 1 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、CaCl2 0.3 g,FeSO4·7H2O 5 mg,M nSO4 1.6 mg,ZnCl2 1.7 mg,CoCl2 2 mg,pH 调至7.2。

酶(CMCase )特性研究(见英文文献)

酶的特性研究

1)pH 值

2)温度

3)不同pH 值对酶稳定性影响

4)不同温度(热稳定性)对酶稳定性影响

5)金属离子酶活性的影响

1 酶催化反应的最适条件

1.1温度对酶活力的影响

将CMCase 测定中的水浴温度分别设为30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃,分别测定测 CMCase 和FPase ,以最高酶活值为100%,得到并比较这两种酶处在不同温度的酶促反应中的相对酶活力,从而确定其最适酶促反应温度。

1.2 pH对酶活力的影响

分别配制 pH 值为 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 的柠檬酸缓冲液用于稀释粗酶液,然后用不同pH 值的柠檬酸缓冲液分别配制浓度为1%的CMC-Na 溶液,分别测定CMCase 和FPase ,以最高酶活值为100%,获得并比较两种酶在不同pH 酶促反应中的相对酶活力,最后确定最适酶促反应pH 值。

2 酶的稳定性研究

2.1 酶的热稳定性研究

将稀释后的粗酶液分别置于 30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃的水浴中恒温处理lh 后,在最适酶促反应条件下测定不同温度处理后的CMCase 和FPase 剩余酶活力,以未做特殊处理的粗酶液作对照,评价两种酶的热稳定性。

2.2 酶的pH 稳定性研究

配制 pH 值为 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 的柠檬酸缓冲液,分别加入粗酶液,在4℃下放置2h 后,在最适酶促反应条件下测定剩余酶活力,以未用缓冲液处理的粗酶液的酶活力为对照,评价两种酶的pH 稳定性。

3 金属离子对酶活力的影响

用最适pH 值的缓冲溶液配制终浓度为l0-3mol/L的Fe2+、Mg2+、Pb2+、Ca2+、Cu2+、Zn2+、Co2+、Na+、Mn2+和K+的离子溶液,并对粗酶液进行稀释,在最适酶促反应条件下测定CMCase 与FPase ,把不加任何金属离子的具有相同的稀释倍数的粗酶液作为对照组,研究金属离子对CMCase 与FPase 的影响。